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Technique Support
技術(shù)應(yīng)用
SPR的激發(fā)方法主要有棱鏡耦合方法、光柵耦合方法、波導(dǎo)耦合方法。其中，棱鏡耦合方法由于技術(shù)成熟度高，目前用已經(jīng)用于大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)。棱鏡耦合方法主要有兩種結(jié)構(gòu)構(gòu)型：Otto型和Kretschman結(jié)構(gòu)（如圖2所示）。
圖2：SPR棱鏡耦合方法兩種結(jié)構(gòu)構(gòu)型的示意圖
在Otto結(jié)構(gòu)中，棱鏡與金屬薄膜之間存在一定的間隙，測量時液體或者氣態(tài)樣品從該間隙流過或通過。此方法需要棱鏡表面與金屬薄膜表面間隙尺寸為微米級或更小，加工設(shè)計時棱鏡表面與金屬薄膜之間的空隙要求平行，且要求大小均勻一致。所以對于機(jī)械固定加工工藝來說，要滿足這種精度要求非常困難，這點(diǎn)限制了Otto結(jié)構(gòu)傳感器的進(jìn)一步的商品化應(yīng)用。
在Kretschmann結(jié)構(gòu)中，棱鏡表面濺射上一定厚度的金屬薄膜，測量時樣品從金膜上流過，通過改變光的波長或者入射角度便可產(chǎn)生SPR現(xiàn)象。這種工藝由于加工要求相對簡單，所以目前大多數(shù)的SPR傳感器，都采用這種的耦合方式[2]。
2. SPR生物傳感器的結(jié)構(gòu)組成
SPR生物傳感器主要有三部分構(gòu)成：包括耦合器件、金屬薄膜和生物表面基質(zhì)。由于SPR是利用反射光譜來進(jìn)行研究的，因此金屬材料首先考慮的是反射率高的金屬?？芍苽浣饘俦∧ぶ饕?/span>Au、Ag、Al、Cu等這幾種金屬材料。這幾種材料中、Ag的反射率最高；Al的高反射率區(qū)最寬且平穩(wěn)，波動最?。?/span>Au、Cu的反射率沒Ag、Al理想，高反射率區(qū)范圍較窄。但是另一方面，金屬膜的化學(xué)穩(wěn)定性也是一個需要考慮的重要因素。在這4種金屬當(dāng)中，A1的穩(wěn)定性最差，極易被氧化，在其表面形成致密的氧化鋁膜層，從而影響SPR的產(chǎn)生；Ag的穩(wěn)定性雖然也不理想，但高于A1；Cu也容易被氧化；Au的穩(wěn)定性最好，不易與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，具有化學(xué)惰性，適合長期使用。所以現(xiàn)在Au膜和Ag膜作為市場上最常用的兩種金屬膜。其中Au膜的穩(wěn)定性最好，具有較強(qiáng)的化學(xué)惰性，尤其適用Ag膜不能使用的體系，是SPR首選的金屬膜[3]。
大多數(shù)SPR傳感芯片的金膜表面都連有一層生物表面基質(zhì)，它一般通過內(nèi)層的自組裝層通過金屬配位鍵連接到金屬薄膜上。生物表面基質(zhì)并不影響SPR的特性，而且這層生物表面基質(zhì)由于在空間上進(jìn)行了拓展，可以為許多生物分子相互作用提供了一個極佳的反應(yīng)環(huán)境。并且，其它分子還可以通過多種方式連接到生物表面基質(zhì)分子上，這樣就大大的擴(kuò)展了相關(guān)SPR生物傳感器的應(yīng)用范圍。目前來說，現(xiàn)在商品化的生物傳感器都是根據(jù)生物表面基質(zhì)不同的偶聯(lián)作用來進(jìn)行分類（如表1）。
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IB-UM |
裸金芯片，可以用于各種生物實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行自行設(shè)計、修飾芯片表面，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方法的摸索。 |
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IB-CM |
表面基團(tuán)羧甲基化修飾，可以通過共價偶聯(lián)來連接小分子、多肽、蛋白、核酸等物質(zhì)。 |
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IB-AM |
表面進(jìn)行了親和素化修飾，可以偶聯(lián)生物素化的蛋白，核酸等物質(zhì)。 |
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IB-NM |
表面進(jìn)行了NTA基團(tuán)修飾，可以偶聯(lián)HIS標(biāo)簽的重組蛋白。 |
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IB-PM |
表面進(jìn)行了蛋白A的修飾，可以定向偶聯(lián)抗體。 |
表1：英柏生物商業(yè)化SPR生物傳感器的簡介
3. SPR檢測技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀：
1982 年瑞典科學(xué)家Liedberg 等人第一次將SPR技術(shù)用于生化傳感器領(lǐng)域，并成功地運(yùn)用其進(jìn)行氣體檢測和Igg蛋白與抗體相互作用，為測量生物分子相互作用奠定了基礎(chǔ)[4]。
1990 年瑞典的 Pharmacia 公司開發(fā)出世界上第一臺商業(yè)化的 SPR生物傳感器 (Biacore AB)，此后 SPR生物傳感器的研究全面展開并不斷深入,其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。
1991 年，Karlsson 等第一次報道了用于對抗原抗體免疫反應(yīng)進(jìn)行動力學(xué)分析的成熟方法，應(yīng)該指出的是，這個動力學(xué)分析方法幾乎可以不加修改的用于許多其他的親和反應(yīng)類別。在這個方法的基礎(chǔ)上，Biacore公司研究團(tuán)隊(duì)及其合作實(shí)驗(yàn)室又很快建立起了許多用于其他類別的生物分子親和反應(yīng)的動力學(xué)分析方法。在生物分子親和反應(yīng)檢測和動力學(xué)分析的另一個重大突破是SPR成功實(shí)現(xiàn)對溶液中小分子[< 5000 D]的檢測和動力學(xué)分析。如今SPR生物傳感器已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)生命科學(xué)、制藥、食品及環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域。近幾年，新的技術(shù)理論和方法學(xué)的發(fā)展又推動了SPR生物傳感器向小分子的相互作用研究、藥物篩選、臨床診斷、細(xì)胞膜模擬、蛋白質(zhì)組學(xué)等新興的應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)展[5]。